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穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀的原理及測(cè)試用途

來(lái)源：時(shí)間：2022-11-28 11:34:55 瀏覽：9106次

1.引言
在歷史進(jìn)程中，為了推動(dòng)社會(huì)不斷發(fā)展，各類科學(xué)技術(shù)前后相繼、層出不窮。在眾多科學(xué)技術(shù)類別中，光譜學(xué)是通過(guò)物質(zhì)（原子、分子、團(tuán)族等）對(duì)光的吸收與發(fā)射來(lái)研究光與物質(zhì)相互作用的一門科學(xué)。其中，激光光譜技術(shù)按照光譜類型可分為以下幾種：吸收光譜、熒光光譜、拉曼光譜、紅外光譜等，不同的光譜從不同角度反映了物質(zhì)的不同特性[1]。
在此，我們先介紹一個(gè)概念：何為光致發(fā)光？物質(zhì)在吸收紫外和可見(jiàn)電光的時(shí)候，其分子受激躍遷至激發(fā)電子態(tài)，大多數(shù)分子將通過(guò)與其它分子的碰撞以熱的方式散發(fā)掉這部分能量；而另一部分分子以光的形式放射出這部分能量，放射光的波長(zhǎng)不同于所吸收輻射的波長(zhǎng)，該過(guò)程稱作光致發(fā)光[2]。
光致發(fā)光可按延遲時(shí)間分為熒光和磷光，其中基于化合物的熒光測(cè)量而建立起來(lái)的分析方法稱為分子熒光光譜法。由于不同種類的物質(zhì)有著不同的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和發(fā)光性質(zhì)，因此可以根據(jù)熒光光譜對(duì)不同種類的熒光物質(zhì)可以進(jìn)行定性及定量分析。
圖1 愛(ài)丁堡FLS980型穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀
我們常見(jiàn)的穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀（圖1）就是一種基于熒光光譜法原理，用于測(cè)定材料發(fā)光性能（如，激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、量子產(chǎn)率、熒光強(qiáng)度以及熒光壽命等）的分析儀器，是一種綜合型的熒光光譜儀，既可以測(cè)得覆蓋200～1700 nm波段的紫外可見(jiàn)-近紅外光的穩(wěn)態(tài)光譜，同時(shí)又可測(cè)得瞬態(tài)光譜。
2.穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀的原理
穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀主要以時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)原理（time-correlated single photon counting）來(lái)作為測(cè)量熒光壽命的工作基礎(chǔ)，該原理簡(jiǎn)稱為“單光子計(jì)數(shù)（SPC）法”，利用脈沖光源激發(fā)樣品后，樣品發(fā)出熒光光子信號(hào)，每次脈沖后只記錄某特定波長(zhǎng)單個(gè)光子出現(xiàn)的時(shí)間t，經(jīng)過(guò)多次計(jì)數(shù)，測(cè)得熒光光子出現(xiàn)的幾率分布P(t)，此P(t)曲線就相當(dāng)于激發(fā)停止后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間衰減的I(t)曲線，這好比一束光通過(guò)一個(gè)小孔形成的衍射圖與單個(gè)光子一個(gè)一個(gè)地通過(guò)小孔長(zhǎng)時(shí)間的累計(jì)可得完全相同的衍射圖的原理是一樣的。
以FS920型穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀為例，如圖2所示。
圖2 穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀原理示意圖[2]
以FS920型穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀為例，在此我們簡(jiǎn)要介紹一下該儀器的工作原理：
時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)原理（time-correlated single photon counting）作為穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀測(cè)量熒光壽命的工作基礎(chǔ)，其簡(jiǎn)稱“單光子計(jì)數(shù)（SPC）法”，其基本原理是，脈沖光源激發(fā)樣品后，樣品發(fā)出熒光光子信號(hào)每次脈沖后只記錄某特定波長(zhǎng)單個(gè)光子出現(xiàn)的時(shí)間t，經(jīng)過(guò)多次計(jì)數(shù)，測(cè)得熒光光子出現(xiàn)的幾率分布P(t)，此P(t)曲線就相當(dāng)于激發(fā)停止后熒光強(qiáng)度隨時(shí)間衰減的I(t)曲線，這好比一束光通過(guò)一個(gè)小孔形成的衍射圖與單個(gè)光子一個(gè)一個(gè)地通過(guò)小孔長(zhǎng)時(shí)間的累計(jì)可得完全相同的衍射圖的原理是一樣的。
當(dāng)熒光光譜儀進(jìn)行工作時(shí)，被測(cè)的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過(guò)單色器變成單色熒光后照射于光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過(guò)放大器放大輸至記錄儀。一個(gè)激發(fā)，一個(gè)發(fā)射，采用雙單色器系統(tǒng)，可分別測(cè)量激發(fā)光譜和熒光光譜。
3.穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀的結(jié)構(gòu)
我們以O(shè)mniFluo900系列穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀（圖3）為例，簡(jiǎn)要介紹該儀器的結(jié)構(gòu)組成：
儀器主要由光源及其電源、激發(fā)光波長(zhǎng)選擇器件、樣品室、發(fā)射光波長(zhǎng)選擇器件、光電探測(cè)器、輸出裝置、儀器控制和數(shù)據(jù)獲取分析和計(jì)算機(jī)組成。其中，高亮度復(fù)色光源及多波長(zhǎng)單色光源、高靈敏度單光子探測(cè)器和大容量樣品室為核心部件，配合精心優(yōu)化的激發(fā)與發(fā)射光路設(shè)計(jì)，能顯著地提高了熒光信號(hào)探測(cè)的靈敏度。
圖3 OmniFluo900系列穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀的結(jié)構(gòu)框圖
4.熒光光譜
穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀對(duì)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)量后的結(jié)果以光譜圖的形式呈現(xiàn)，通常情況下，熒光光譜包括激發(fā)光譜與發(fā)射光譜兩種（圖4），其中[3]：
圖4 熒光光譜示意圖[2]
（a）激發(fā)光譜是熒光強(qiáng)度以激發(fā)波長(zhǎng)為函數(shù)的光譜
激發(fā)光譜是熒光物質(zhì)在不同波長(zhǎng)的激發(fā)光作用下測(cè)得的某一波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度的變化情況，也就是不同波長(zhǎng)的激發(fā)光的相對(duì)效率。
研究分子的激發(fā)光譜時(shí)，保持激發(fā)光強(qiáng)度不變，連續(xù)地調(diào)諧激發(fā)光的波長(zhǎng)，并探測(cè)在某波長(zhǎng)位置上分子發(fā)射的熒光強(qiáng)度變化。如測(cè)量波長(zhǎng)選擇在發(fā)射強(qiáng)度的峰值處，則所測(cè)量得的激發(fā)光譜強(qiáng)度最大。通常激發(fā)光譜的形狀與吸收光譜的形狀很相像，因?yàn)榉肿拥奈者^(guò)程也是它的激發(fā)過(guò)程。
（b）發(fā)射光譜是熒光在發(fā)射波長(zhǎng)上的強(qiáng)度分布
發(fā)射光譜是在某一固定波長(zhǎng)的激發(fā)光作用下，熒光強(qiáng)度在不同波長(zhǎng)處的分布情況，也就是熒光中不同波長(zhǎng)的光成分的相對(duì)強(qiáng)度。
測(cè)量發(fā)射光譜時(shí)，激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度均保持不變，用發(fā)射單色儀進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，記錄在不同波長(zhǎng)上的熒光強(qiáng)度就得到發(fā)射光譜。由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)有相似的振動(dòng)能級(jí)分布，而且從基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的幾率與第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的幾率也相近，因此吸收譜與發(fā)射譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系。
熒光光譜具有以下三個(gè)主要特點(diǎn)[2]：
（a）Stokes位移：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間有波長(zhǎng)差，發(fā)射光譜波長(zhǎng)比激發(fā)光譜波長(zhǎng)長(zhǎng)；
（b）發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)；
（c）鏡像規(guī)則，熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜成鏡像對(duì)稱關(guān)系。
從得到的熒光光譜中，我們可以獲得以下主要譜參數(shù)[1]：
（a）激發(fā)光譜和發(fā)射光譜：激發(fā)光譜與吸收光譜極為相似，呈正相關(guān)；吸收光譜與發(fā)射光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系；
（b）熒光壽命：去掉激發(fā)光后，分子的熒光強(qiáng)度降到去掉激發(fā)光時(shí)刻熒光強(qiáng)度I0的1/e所需要的時(shí)間，稱為熒光壽命（如圖5）；
圖5 熒光壽命示意圖[2]
（c）量子產(chǎn)率: 熒光量子產(chǎn)率是物質(zhì)熒光特性中最基本的參數(shù)之一。它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的效率，通常用?來(lái)表示，定義為發(fā)射量子數(shù)和吸收量子數(shù)之比，即由熒光發(fā)射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例，又稱為熒光效率。
（d）熒光強(qiáng)度：測(cè)定熒光的相對(duì)強(qiáng)度與一些因素有關(guān)。熒光的相對(duì)強(qiáng)度可以用式1-1表示：
式中，F(xiàn)---熒光強(qiáng)度，K---儀器常數(shù)，?---量子產(chǎn)率，I---激發(fā)光強(qiáng)度，a---摩爾吸收系數(shù)，d---樣品池的光徑，c---樣品的濃度。
5.穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜分析的原理與特點(diǎn)
5.1 原理
穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜分析是一種基于物質(zhì)的光致發(fā)光現(xiàn)象而產(chǎn)生的熒光的特性及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)的定性和定量的分析方法：
（a）定性分析：不同結(jié)構(gòu)熒光化合物都有特征的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，因此可以將熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的形狀、峰位與標(biāo)準(zhǔn)溶液的光譜圖進(jìn)行比較，從而達(dá)到定性分析的目的。
（b）定量分析：在低濃度時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比：F=Kc。其中，F(xiàn)為熒光強(qiáng)度，c為熒光物質(zhì)濃度，K為比例系數(shù)。這就是熒光光譜定量分析的依據(jù)。
值得注意的是，上述關(guān)系不適用于熒光物質(zhì)濃度過(guò)高的情況，熒光物質(zhì)濃度過(guò)高，其熒光強(qiáng)度反而降低。
5.2 特點(diǎn)
穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜分析具有以下特點(diǎn)[4]：
優(yōu)點(diǎn)：
（a）靈敏度高；
（b）選擇性強(qiáng)；
（c）試樣量少、方法簡(jiǎn)單；
（d）提供較多的物理參數(shù)。
缺點(diǎn)：
（a）應(yīng)用范圍不夠廣泛;
（b）對(duì)環(huán)境敏感，存在多種干擾因素。
6.儀器功能
穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，主要得益于其能實(shí)現(xiàn)多種功能性測(cè)試：
（a）能夠?qū)崿F(xiàn)不同類型樣品（包括液體，固體，薄膜以及粉末）的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜（200～1700 nm）、同步掃描、動(dòng)力學(xué)光譜、三維光譜的測(cè)試；
（b）通過(guò)配備紫外可見(jiàn)區(qū)多個(gè)波段皮秒脈沖激光器以及超連續(xù)穩(wěn)態(tài)/脈沖白光激光器，能夠?qū)崿F(xiàn)覆蓋紫外可見(jiàn)近紅外波段穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)激發(fā)，能夠分別進(jìn)行熒光壽命、上轉(zhuǎn)換熒光壽命（30 ps～50 μs, 200 nm～1700 nm）和磷光壽命（1 μs～10 s, 200 nm～1700 nm）測(cè)試；
（c）利用大口徑積分球置于樣品倉(cāng)內(nèi)，通過(guò)直接光路測(cè)量絕對(duì)熒光量子產(chǎn)量（200 nm～1700 nm）；
（d）能夠進(jìn)行不同溫區(qū)的變溫?zé)晒鈱?shí)驗(yàn)（4 K～500 K）；
（e）配備偏振附件能夠?qū)崿F(xiàn)熒光各向異性測(cè)試；
（f）可進(jìn)一步同顯微鏡耦合，進(jìn)行微區(qū)穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光測(cè)量、電致熒光測(cè)量等。
7.制樣要求
使用穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀對(duì)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，首先應(yīng)確定樣品具有熒光/磷光性能，樣品應(yīng)在光激勵(lì)下發(fā)光，否則所有熒光類測(cè)試都沒(méi)有意義！進(jìn)行測(cè)試時(shí)的制樣要求如下：
（a）常規(guī)熒光、磷光、壽命等測(cè)試：液體、粉末、薄膜（如果有襯底，請(qǐng)選用硅片等不發(fā)光、弱發(fā)光襯底）均可，具體而言：
液體要1 mL以上，一般5 mL左右，可能有溶度猝滅、溶劑效應(yīng)等因素帶來(lái)的影響，所以濃度根據(jù)自己樣品情況把控，不做要求；
粉末需要研磨較細(xì)，一般需要20 mg以上，需要填滿長(zhǎng)1 cm、寬0.5 cm、深0.2 cm的槽；
塊狀或薄膜樣品要求基底尺寸在1×1 cm～2×2 cm之間，大約指甲蓋大小即可；
（b）變溫測(cè)試：變溫測(cè)試都不接受易揮發(fā)、易腐蝕的樣品，如高溫下有危害性需提前告知儀器操作者：
粉末需壓成厚度1 mm左右，直徑5 mm～1 cm左右的片子；
有襯底的薄膜樣品可以直接使用；
液體樣品，一定要備注好溶劑是什么、膨脹系數(shù)多大（如果膨脹系數(shù)過(guò)大，低溫下迅速結(jié)冰，會(huì)撐破比色皿）；
（c）絕對(duì)熒光量子產(chǎn)率測(cè)試：激發(fā)波長(zhǎng)需≥340 nm；固體樣品用硫酸鋇作空白樣，溶液的樣品以溶劑作空白樣，所以溶液樣品測(cè)產(chǎn)率需同時(shí)提供溶劑。
8.應(yīng)用現(xiàn)狀
由于穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜分析技術(shù)具有重復(fù)性好、靈敏度高、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，且作為目前分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)與成分的有力手段之一，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，具體而言包括以下幾個(gè)方面：
（a）熒光物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析；
（b）有熒光特性成分的定量分析；
（c）測(cè)試熒光量子產(chǎn)率；
（d）熒光壽命和磷光壽命測(cè)定；
（e）時(shí)間分辨熒光光譜測(cè)定；
（f）熒光偏振性質(zhì)測(cè)定。
張?jiān)伒热薣5]利用英國(guó)Edinburgh FLS920P型的穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀，對(duì)互為同分異構(gòu)體的胭脂紅、莧菜紅分子的吸收光譜和熒光光譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，得到二者的光譜特性參數(shù)，并進(jìn)行對(duì)比。
胭脂紅、莧菜紅的吸收光譜和熒光光譜如圖6所示，其中圖6（a）為兩種物質(zhì)的吸收光譜，圖6（b）為兩種紅色素在發(fā)射波長(zhǎng)450 nm下的激發(fā)光譜；圖6（c-d）為三維熒光光譜；圖6（e-f）為330 nm光激發(fā)下兩種色素的發(fā)射光譜，圖中的部分光譜特性參數(shù)如表1所示。從中可以看出，胭脂紅、莧菜紅兩種同分異構(gòu)體的吸收光譜（圖6a）線型相似，且都含有251與330 nm的吸收峰；不同之處為它們的最大吸收峰值波長(zhǎng)分別為 506和521 nm，因此可以作為兩種物質(zhì)的特征吸收波長(zhǎng)。熒光光譜也存在差異，它們的發(fā)射波長(zhǎng)分別450和421 nm，且在同一波長(zhǎng)的激發(fā)下，莧菜紅的熒光峰值強(qiáng)度明顯大于胭脂紅，如圖6（e-f）所示。
圖6 胭脂紅與莧菜紅的（a）吸收光譜和（b-f）熒光光譜[5]
表1 胭脂紅與莧菜紅的吸收光譜和熒光光譜特征參數(shù)
楊珀等人[6]利用FLS920型穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物QPXF在不同種類的溶劑中進(jìn)行熒光測(cè)試，實(shí)驗(yàn)中以365 nm波長(zhǎng)激發(fā)，目標(biāo)產(chǎn)物QPXF在DCM、DMF、EA、乙醇和CN（5×10–5 mol/L）中的溶液熒光如圖7所示。
從結(jié)果中可以看出，QPXF的溶液熒光受溶劑極性影響，在極性小的DCM和EA中為λem = 460 nm的藍(lán)光，在極性大的DMF，ETOH和CN中為λem = 505 nm左右的藍(lán)綠色光。同時(shí)，溶液熒光強(qiáng)度隨著溶劑極性的增大而減小。
圖7 QPXF 在不同溶劑中的熒光圖譜[6]
9.結(jié)語(yǔ)
利用穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀可以對(duì)具有不同結(jié)構(gòu)的熒光化合物進(jìn)行定性與定量分析，得益于靈敏度高、試樣量少、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，該光譜儀在物理、化學(xué)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，對(duì)于推動(dòng)科學(xué)研究的進(jìn)步具有重要意義！
10.參考文獻(xiàn)
[1] 周穎. 超支化聚芴衍生物的穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜特性[D]. 西安電子科技大學(xué), 2008.
[2] 【科研方法15】一文帶你看懂穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜原理與應(yīng)用
[3] 趙南明，周海夢(mèng)．生物物理學(xué)．高等教育出版社．2000，17：289—293．
[4] 姚文華. 熒光分析儀的原理及其在生化工程上的應(yīng)用[J]. 醫(yī)藥工程設(shè)計(jì), 1991.
[5] 張?jiān)? 陳國(guó)慶, 朱純,等. 胭脂紅和莧菜紅分子結(jié)構(gòu)與光譜性質(zhì)的對(duì)比研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2015, 35(11):3017-3022.
[6] 楊珀, 錢永, 袁月鵬. 一種新型席夫堿的合成及其紫外線屏蔽性能[J]. 工程塑料應(yīng)用, 2020, v.48;No.364(02):106-111.

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