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電子順磁共振波譜儀（上）：儀器原理與應(yīng)用

來源：測試GO 時間：2021-01-21 18:10:08 瀏覽：13420次

1引言

1895年，荷蘭物理學(xué)家Zeeman發(fā)現(xiàn)在磁場的作用下，光譜的譜線產(chǎn)生分裂，且譜線分裂程度與磁場強度相關(guān)的現(xiàn)象，稱為“Zeeman效應(yīng)”[1]。

2發(fā)展歷史

圖1

電子順磁共振(Electronparamagneticresonance,EPR)技術(shù)是利用未成對電子對順磁性物質(zhì)進行化學(xué)結(jié)構(gòu)信息分析的波譜學(xué)檢測法。EPR技術(shù)發(fā)源于物理學(xué)研究，最初用來研究某些復(fù)雜原子的電子結(jié)構(gòu)、原子偶極矩與分子結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)等問題，后來延伸到了生物化學(xué)領(lǐng)域中對有機化合物的分析表征。目前，EPR測試技術(shù)已在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、能源科學(xué)等許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。值得一提的是，EPR能在不影響反應(yīng)的前提下，獲取正在進行的物理和化學(xué)反應(yīng)中的物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息和動態(tài)信息，是一種有效的原位機理解析手段。

1925年，Uhlenbeck等提出電子的磁矩是由電子的自旋運動貢獻的。

1945年，F(xiàn)renkel及其合作者在使用133MHz的交變電磁波照射CuCl2·2H2O樣品時檢測到了電磁波被共振吸收的信號，從此宣告了“電子磁共振”的誕生。并證明了更高的微波頻率和更高的外磁場條件更有利于檢測到EPR信號。

1946年，美國哈佛大學(xué)的Purcell等在實驗室中觀測到了“核磁共振”(Nuclearmagneticresonance,NMR)現(xiàn)象。

1952年，Hutchison采用EPR技術(shù)獲得了第一個有機自由基的波譜結(jié)果，是首次將EPR技術(shù)應(yīng)用在非物理學(xué)領(lǐng)域，并引起了化學(xué)家、生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家的廣泛關(guān)注。

20世紀(jì)50年代，磁共振譜儀得到了極其快速的發(fā)展。60年代末，由于低溫技術(shù)、原位檢測和自旋捕捉等新型實驗技術(shù)的發(fā)展，磁共振譜儀的儀器結(jié)構(gòu)得到了極大的改良和發(fā)展，應(yīng)用范圍得到進一步拓廣。

3理論基礎(chǔ)

3.1磁共振原理

原子中的電子能進行兩種運動：一種是圍繞原子核的軌道運動，一種是圍繞通過其中心的軸所作的自旋運動，兩種運動分別產(chǎn)生軌道磁矩和自旋磁矩。當(dāng)自由電子處于外加磁場B0中時，與外加磁場的相互作用將使電子的自旋能級從簡并態(tài)分裂為兩個能級，這就是電子自旋磁矩在外磁場中能量的塞曼分裂（Zeemansplitting）。如下圖2所示。

圖2

3.2吸收-弛豫-吸收過程

圖3

3.3場調(diào)制

最廣泛使用的連續(xù)調(diào)波EPR光譜的結(jié)果通常是表現(xiàn)測量吸收信號的一次微分值的譜線，這一過程是依靠一個外加的高頻調(diào)制場來將吸收信號解析出來的。調(diào)制線圈纏繞在諧振腔的外側(cè)，使產(chǎn)生的調(diào)制磁場方向與外加磁場一致。在慢速掃描的主磁場上再疊加一個高頻、低幅的調(diào)制磁場，調(diào)制頻率一般為100kHz。通過相敏檢波器檢測峰間幅值，可以獲得到吸收信號的一次導(dǎo)數(shù)信號。

圖4

由于這種場調(diào)制的方法使用了相敏檢波器，僅有相同頻率調(diào)制的信號（100kHz）可被檢測到，這種采用了高頻調(diào)制和相敏檢波的檢測方法能夠顯著提高信噪比。為了進一步提高儀器的分辨率，現(xiàn)代波譜儀還能觀測二次微分曲線形式的測量結(jié)果。

4儀器結(jié)構(gòu)

電子順磁共振波譜儀主要由微波橋、電磁鐵系統(tǒng)、傳導(dǎo)系統(tǒng)、微波諧振腔、檢測系統(tǒng)、調(diào)制系統(tǒng)構(gòu)成。

微波橋：微波橋由產(chǎn)生、控制和檢測微波輻射的器件組成。微波頻率一般為1≤ν≤100GHz。常用的微波源有速調(diào)管和耿氏二極管。速調(diào)管在波譜儀中廣泛作為微波源被使用，具有穩(wěn)定、高能、噪聲低的優(yōu)勢，能有效提高儀器分辨率。微波源后緊接著一個隔離調(diào)制器，用于減弱反射回源，維持微波頻率的穩(wěn)定。

圖5

電磁鐵系統(tǒng)：EPR光譜儀中的電磁鐵系統(tǒng)要求能夠提供強度符合需要的、穩(wěn)定的、均勻的磁場，磁性組件包括磁體和磁場傳感器。EPR光譜儀使用的磁體主要有兩種：第一種是電磁體，通常能夠產(chǎn)生高達1.5T的場強，適合在Q波段頻率進行測量。第二種是超導(dǎo)磁體，適用于W波段和更高頻率下進行操作。根據(jù)工作微波頻率協(xié)調(diào)所需的磁場強度范圍，從而進行磁體種類的選取。

傳導(dǎo)系統(tǒng)：傳導(dǎo)系統(tǒng)負(fù)責(zé)將產(chǎn)生的微波傳導(dǎo)到指定位置，由隔離器、衰減器、環(huán)形器、波導(dǎo)管等重要器件連接而成。產(chǎn)生于微波源的電磁波通過定向耦合器被分成兩條路徑：一條路徑指向諧振空腔，另一條路徑指向參考臂。在兩個路徑上都有一個可變衰減器，能夠精確控制產(chǎn)生微波的功率。在諧振空腔路徑上，微波與樣品相互作用，產(chǎn)生用于分析的共振吸收信號。在參考臂上，可變衰減器之后有一個移相器，可在參考信號和反射信號之間設(shè)定相位關(guān)系。

諧振腔：諧振腔好比EPR譜儀的心臟，它是一種方形或圓柱狀的金屬盒，用于放置樣品、產(chǎn)生信號、放大信號、檢測信號。樣品放置在諧振腔中，產(chǎn)生的微弱信號在諧振腔內(nèi)部通過共振被進一步放大，當(dāng)能級分裂接近于入射微波光子的頻率時，就能夠通過固態(tài)二極管檢測得出吸收線。諧振腔存儲微波能量的能力由品質(zhì)因數(shù)Q給出，Q值越高，光譜儀的靈敏度越高。

檢測系統(tǒng)：載有信號的微波經(jīng)環(huán)形器被傳導(dǎo)出諧振腔，先經(jīng)過檢波后進入100kHz窄頻帶放大器，隨后進入相敏檢波器，在這里只檢出與參考信號的頻率與相位都相同的接收信號。相敏檢波器輸出的信號經(jīng)過放大后送入電腦。

調(diào)制系統(tǒng)：大多數(shù)外部元件，如微波源發(fā)生器和檢測器等都包含在微波橋接控制中，通過調(diào)制系統(tǒng)控制輸入及輸出的微波頻率。調(diào)制系統(tǒng)的作用在于降低噪聲、提高譜儀靈敏度。

4.1儀器工作原理

在EPR儀器中，電磁鐵系統(tǒng)產(chǎn)生的磁場與經(jīng)波導(dǎo)管傳導(dǎo)至諧振腔的電磁波相互垂直，也與掃描線圈互相垂直。當(dāng)電磁波的頻率ν0和磁場強度H0滿足共振吸收條件時，放置在諧振腔中的樣品就要發(fā)生共振而吸收能量。吸收信號在諧振腔中被放大后，經(jīng)過相敏檢出放大后即可顯示于示波器上，并被記錄儀自動記錄下來。

4.2制樣要求

（1）氣體樣品的制備：

常見的氣體樣品如測試香煙中的自由基含量，主要的制樣手段是對煙氣進行富集，以達到測試需求的測試濃度。

（2）液體樣品的制備：

①溶劑選擇：對于極性大的溶劑，要將樣品放在毛細管中進行測試，以避免溶劑對微波的吸收；

②除氧操作：液體中的氧氣對信號的干擾非常大，因此需要對樣品進行通氮或者真空除氧，以保證測試過程中能看到精細的結(jié)構(gòu)信息；

未除氧

除氧

圖6

③濃度控制：濃度過大或過小都會對樣品信號造成干擾，導(dǎo)致精細結(jié)構(gòu)的丟失，因此選擇適當(dāng)?shù)臐舛葘y試結(jié)果有幫助。

（3）固體樣品的制備：

①除潮處理：保護EPR圖譜細節(jié)不受影響；

②樣品粒徑：要注意固體樣品的顆粒大小，以免堵塞送樣管；

③稀釋操作：粉末樣品的順磁濃度如果太大也會對信號造成干擾，可以采用干燥硅膠或碳酸鈣進行固體稀釋。

（1）溫度作用：溫度對信號的影響主要體現(xiàn)在兩個方面，一是熱擾動對測試結(jié)果造成干擾；二是高溫信號的存活時間較短，難以捕捉。因此一些諸如固體表面空穴檢測、過渡金屬的不穩(wěn)定價態(tài)測試等都需要在液氮的低溫環(huán)境中才能較好的采集到信號。

（2）樣品濃度：樣品濃度過高時分子間的距離較近，會使電子自旋-自旋相互作用更強，影響儀器分辨率；過低會接近儀器檢出限，影響結(jié)果的靈敏度。因此需要采用分散劑，對樣品濃度進行合適的調(diào)整。

圖6不同干燥手法對EPR波譜的影響

圖7

4.3影響因素

（3）磁場調(diào)制：磁場調(diào)制幅度過大或頻率與譜線過于接近時會影響檢波器的輸出信號，引起譜線畸變失真。

（4）樣品種類：確定樣品種類及順磁中心性質(zhì)對調(diào)整微波頻率與磁場場強有著重要的參考價值。比如水溶液中的樣品，尤其是生物樣品，主要通過介電過程吸收微波，而介電損耗在很大程度上受到頻率的影響，因此為了保證能夠有效觀測到EPR信號，需要選擇較低的微波頻率。

5應(yīng)用

EPR技術(shù)起源于物理學(xué)研究，但只要能在樣品中形成未成對電子就能加以研究，其應(yīng)用幾乎遍及一切材料。

5.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化分析

在生物過程中存在著大量的自由基問題，如植物的光合作用、金屬蛋白質(zhì)的催化過程等。因此，電子順磁共振波譜技術(shù)是在分子及細胞水平上研究生物醫(yī)學(xué)問題的關(guān)鍵工具。由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進行生物學(xué)活動時，其構(gòu)象就發(fā)生改變，因此可以通過研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化對生物學(xué)過程進行分析。

圖8

在采用EPR技術(shù)對生物學(xué)蛋白質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)解析的過程中，可以采用自旋標(biāo)記技術(shù)，逐點定位標(biāo)記自由基，獲取一系列EPR譜圖，從譜圖分析獲取其二維結(jié)構(gòu)，再輔以長程約束手段，最終獲取完整的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。在此基礎(chǔ)上，可以定點將標(biāo)記探針引入感興趣的位點，在不干擾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的前提下，追蹤蛋白質(zhì)在生物活動中發(fā)生的構(gòu)象改變。

AliseR.Muok等[6]就是根據(jù)上述實驗思路，采用β修飾的二磷酸腺苷作為自旋標(biāo)記探針，通過研究標(biāo)記物側(cè)鏈的動力學(xué)信息，對反應(yīng)蛋白標(biāo)記位點的周圍環(huán)境和空間變化進行了研究。并且證實采用β修飾得到的ADP-β-S-SL是一種有效的進行雙電子電子共振（DEER）光譜實驗的探針工具。

5.2原位電化學(xué)過程研究

EPR光譜技術(shù)的一大特點是可在不影響物理、化學(xué)、生物反應(yīng)過程的前提下對樣品進行表征，因此具有原位表征的潛力。英國曼徹斯特大學(xué)的王斌等人[7]應(yīng)用EPR技術(shù)對活性炭在水溶液中的電化學(xué)電容儲存過程進行了原位檢測。

實驗結(jié)果表明，EPR信號強度和雙積分值都隨著充電過程而增加，隨后在放電過程中可逆的恢復(fù)。

此外，綜合EPR光譜線形及其溫度依賴性分析得知，在活性炭的雙電容行為中存在兩種自旋行為：缺陷處的自旋，產(chǎn)生窄信號；表面芳族自旋，形成寬信號。在每種電解質(zhì)溶液中都能夠看到窄信號的電勢依賴性響應(yīng)，而寬信號的變化僅在較高濃度下發(fā)生。結(jié)果表明，窄信號的增加是由于官能團還原形成自由基，引起了未成對電子密度增加，寬信號的電勢依賴性可能與離子進一步吸附到活性炭的深層多孔結(jié)構(gòu)中有關(guān)。

圖9

6新式儀器種類

傳統(tǒng)EPR儀器采用的是固定微波頻率、掃描磁場的方法，稱為連續(xù)波-EPR（CW-EPR,continuouswave-EPR）儀器。近些年，隨著附加器件的開發(fā)，發(fā)展出了脈沖-EPR和快速掃描-EPR技術(shù)，使EPR技術(shù)進入了多樣化領(lǐng)域，能夠獲得更加多樣的信息，樣品測量范圍進一步擴大。

6.1脈沖-EPR

脈沖波激發(fā)EPR技術(shù)實際上是一種弛豫測量工具，在脈沖波的激發(fā)下，自旋體系的弛豫現(xiàn)象被放大，能夠提供有別于連續(xù)波激發(fā)共振的信息。

脈沖技術(shù)的實現(xiàn)只需對微波源器件進行簡單的附件添加和調(diào)整。在微波源設(shè)置脈沖程序控制開關(guān)，就可以輸出具有一定間隔的脈沖微波。脈沖EPR擁有多頻、多共振和任意波形模式。脈沖-EPR的優(yōu)勢在于：能夠提高g因子分辨率；放大微波功率；使用脈沖微波激發(fā)的共振躍遷信號無需經(jīng)過磁場調(diào)制就能進行檢測；改變激發(fā)電磁波的脈沖序列，可以獲得有關(guān)順磁化合物的更廣泛信息。但與CW-EPR相比，脈沖-EPR無法激發(fā)得到整個光譜信息，且由于帶寬更大，靈敏度受到限制。

圖10

6.2快速掃描-EPR

快速掃描-EPR（RS-EPR,rapidscanning-EPR）技術(shù)結(jié)合了CW-EPR和脈沖-EPR的發(fā)聲原理，更適合用于研究快速反應(yīng)動力學(xué)。在快速掃描-EPR時，磁場在比電子自旋弛豫時間更短的時間內(nèi)對樣品進行共振掃描。

快速掃描信號的優(yōu)勢在于能夠提供全譜檢測，并且適用于在不飽和情況下提供更高的微波功率，尤其適合低頻EPR成像；快速掃描EPR波譜能夠同時測量自旋系統(tǒng)響應(yīng)吸收和色散分量，可以顯著提高信噪比。

與脈沖-EPR相比，快速掃描-EPR具有更高的靈敏度、更佳的空間分辨率、更短的采集時間，并能在單位時間內(nèi)進行更多的臨床前成像測量，這種技術(shù)對于進行臨床體內(nèi)研究尤其重要。

7展望

電子順磁共振波譜是針對順磁性物體進行結(jié)構(gòu)分析與反應(yīng)過程解析的有力表征方式，即使樣品中不存在順磁中心，也能夠采用人工方法形成未成對電子，因此適用于廣泛的樣品種類。而且隨著外加附件的研究與發(fā)展，電子順磁共振技術(shù)的表征手段更加多樣化，應(yīng)用范圍進一步拓寬。更重要的是，它是一門有效的原位表征技術(shù)，因此在研究致癌機理、臨床反應(yīng)、催化原理等過程及其中間產(chǎn)物問題時具有強大的分析能力。綜上所述，電子順磁共振波譜在生物醫(yī)學(xué)、電化學(xué)等領(lǐng)域具有無窮的應(yīng)用潛力。

參考文獻

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[2]https://en.wikipedia.org/wiki/Zeeman_effect

[3]ProsserKE,WalsbyCJ.ElectronParamagneticResonanceasaToolforStudyingtheMechanismsofParamagneticAnticancerMetallodrugs[J].EuropeanJournalofInorganicChemistry,2016,2017.

[4]https://en.wikipedia.org/wiki/Electron_paramagnetic_resonance

[5]WilfredRaymondHagen.BiomolecularEPRspectroscopy[J].BiomolecularEprSpectroscopy,2014.

[6]MuokAR,ChuaTK,LeH,etal.NucleotideSpinLabelingforESRSpectroscopyofATP-BindingProteins[J].APPLIEDMAGNETICRESONANCE,2018.

[7]WangB,FieldingAJ,DryfeRAW.Insituelectrochemicalelectronparamagneticresonancespectroscopyasatooltoprobeelectricaldoublelayercapacitance[J].ChemicalCommunications,2018,54(31).

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