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超強干貨丨一文看懂WB、qPCR生物測試，內(nèi)含常見問題（附答案）

來源：測試GO 時間：2023-02-13 09:53:10 瀏覽：8390次

01

蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）

實驗簡介

蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）又稱免疫印跡（immunoblotting），是采用印跡技術(shù)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，再根據(jù)抗原-抗體的特異性結(jié)合，檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法，該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

實驗原理

WB實驗是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將混合蛋白質(zhì)樣品分離后，利用特殊虹吸或電場裝置印跡至固相介質(zhì)（例如PVDF膜）上，再以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與相對應(yīng)的第一抗體特異性結(jié)合，之后再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體相結(jié)合，最終通過底物顯色或放射自顯影來檢測特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。

實驗流程

蛋白質(zhì)印跡常見問題

一、為什么蛋白質(zhì)印跡條帶大小與預(yù)期的不同？

蛋白質(zhì)印跡是一種基于蛋白質(zhì)大小來分離蛋白質(zhì)的技術(shù)。一般來講，蛋白質(zhì)越小，在膠上的遷移速度越快。但遷移速度也受其它因素的影響，因此，觀察到的實際條帶大小可能與預(yù)測的不同。

常見的因素包括：

1.翻譯后修飾：例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白質(zhì)大小。

2.翻譯后切割：例如許多蛋白先被合成為前蛋白，然后被切割產(chǎn)生活性形式，例如前半胱天冬酶。

3.剪接變體和異形體：可變剪接和異形體可能從同一基因產(chǎn)生不同大小的蛋白質(zhì)。

4.相對電荷-氨基酸（帶電和不帶電）多聚體組分，例如蛋白質(zhì)的二聚化。這種情況通常在還原條件下需要防止，但強相互作用會導(dǎo)致較大的條帶出現(xiàn)。

二、應(yīng)該上樣多少樣品？

細(xì)胞裂解物、膜裂解物和核裂解物：每孔上樣20-30g總蛋白?？筛鶕?jù)測試樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行一些優(yōu)化。純化蛋白（重組或內(nèi)源）：上樣10至100ng蛋白。

三、蛋白樣本為什么要進(jìn)行還原和變性？

為了使樣本被還原和變性，樣品緩沖液中會含有十二烷基硫酸鈉(SDS)和β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)。SDS是一種變性劑，用來打破蛋白的高級結(jié)構(gòu)，變成初級的氨基酸結(jié)構(gòu)，同時以恒定的質(zhì)量比包被蛋白質(zhì)，使其帶上負(fù)電荷。這一恒定的負(fù)電荷比是下一步凝膠電泳分離的關(guān)鍵。β-巰基乙醇和DTT都是還原劑，用來斷開蛋白自身的二硫鍵，進(jìn)一步使蛋白質(zhì)變成線性結(jié)構(gòu)。順便提一下，有些抗體只能夠識別目標(biāo)蛋白的天然結(jié)構(gòu)，在這種情況下，樣本不需要被還原和變性，所以還原和變性的步驟可以省略。但是，大多數(shù)蛋白質(zhì)印跡分析都需要在還原和變性的體系中進(jìn)行。

四、轉(zhuǎn)膜選擇半干轉(zhuǎn)還是濕轉(zhuǎn)？

常用的轉(zhuǎn)印方法有兩種，濕法和半干法。這兩種方法的主要區(qū)別在于，濕法轉(zhuǎn)印中，夾心層被浸沒在注有電轉(zhuǎn)緩沖液的槽中，而在半干法中，夾心層被直接置于陰極與陽極之間。半干法較快，但膜可能會干掉導(dǎo)致蛋白無法轉(zhuǎn)印。濕法轉(zhuǎn)印用時較長，但對于大分子蛋白或疏水蛋白等較難轉(zhuǎn)印的蛋白，這個方法更適合。

五、為什么檢測重組蛋白時難以獲得條帶？

抗體檢測重組蛋白質(zhì)時，存在難以克服的困難，有必要加以考慮。所以推薦確保樣品中表達(dá)的重組蛋白包含所用抗體的免疫原序列。同時，如果重組蛋白帶有標(biāo)簽，標(biāo)簽可能阻止抗體接近表位。盡可能讓標(biāo)簽位于重組蛋白的C或N末端，以降低這種情況發(fā)生的可能性（而不是位于蛋白質(zhì)的閱讀框中間）。

六、牛奶和 BSA 封閉有區(qū)別？

抗體可能對封閉劑敏感，一般來講，BSA會產(chǎn)生更清晰的結(jié)果，因為BSA含有較少的蛋白，因而抗體較少與其發(fā)生交叉反應(yīng)。但并非總是如此，有些抗體在牛奶中的效果更好，因為牛奶含有更多種類的封閉蛋白，能封閉更多不同類型的蛋白質(zhì)。

七、能否用室溫下孵育一抗 1 小時代替 4 ℃ 過夜孵育？

蛋白質(zhì)印跡中一抗孵育時間需要用戶進(jìn)行最終優(yōu)化。一般來講，4 ℃ 過夜孵育將產(chǎn)生更高效、更特異的染色。但許多抗體在室溫下孵育1或2小時效果也非常好。

實驗結(jié)果常常出現(xiàn)的問題

一、無信號

1.一抗和二抗不相容，使用針對一抗來源物種產(chǎn)生的二抗（例如，一抗來源于兔，使用抗兔二抗）。

2.結(jié)合到目標(biāo)蛋白的一抗或二抗不足，使用更高濃度的抗體，或在4℃下孵育更長時間（例如過夜孵育）。

3.封閉劑和一抗或二抗之間發(fā)生交叉反應(yīng)，使用溫和去垢劑，例如Tween20，或更換封閉劑（常用的封閉劑是牛奶、BSA、血清或明膠）。

4.一抗不識別測試物種中的蛋白查看數(shù)據(jù)表或進(jìn)行BLASTp比對，檢查抗體是否應(yīng)與目標(biāo)蛋白反應(yīng)。

5.抗原不足，每個泳道上樣至少20–30μg蛋白，使用蛋白酶抑制劑。

6.組織中目標(biāo)蛋白豐度不夠，利用富集步驟使信號達(dá)到最大（例如，對于核蛋白，制備核裂解物）。

7.蛋白轉(zhuǎn)膜效果差，用可逆染料（例如麗春紅）檢查轉(zhuǎn)膜情況。如果蛋白未有效轉(zhuǎn)膜，檢查轉(zhuǎn)膜方向是否正確。如果使用PVDF膜，確保先將膜預(yù)浸在甲醇中，然后預(yù)浸在轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

8.膜洗滌過度減少洗滌步驟的數(shù)量或縮短洗滌步驟的時間。

二、“微笑”︶條帶呈笑臉狀

說明凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好；電泳系統(tǒng)溫度偏高，這種情況在用較厚凝膠時常發(fā)生。

三、“皺眉”︵條帶呈皺眉狀

這種現(xiàn)象常常是由于裝置不合適，特別是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全就會產(chǎn)生這種現(xiàn)象。

四、“拖尾”現(xiàn)象和背景高

拖尾是電泳中最常見的現(xiàn)象，常常是由于樣品溶解不佳引起的。解決辦法為加樣前離心，選用合適的樣品緩沖液和凝膠緩沖液，加增溶輔助試劑，降低凝膠濃度。背景高是封閉時間不夠，延長封閉時間。優(yōu)化封閉試劑的類型和濃度；封閉試劑和抗體有交叉反應(yīng)，則需要更換封閉試劑。磷酸化抗體不能使用含有酪蛋白的封閉試劑，推薦BSA封閉；一抗/二抗?jié)舛忍邥r應(yīng)降低抗體濃度。洗膜不充分，5*3mins，多次短時間的洗膜；曝光時間過長，應(yīng)縮短曝光時間。出現(xiàn)干膜現(xiàn)象保證膜充分浸透，避免出現(xiàn)干膜。

五、非特異性條帶現(xiàn)象

在標(biāo)本制備時，二聚體或者多聚體應(yīng)增加上樣前煮沸變性時間；蛋白不同剪切體或者異構(gòu)體存在；若蛋白樣品降解，應(yīng)使用新制備的標(biāo)本，標(biāo)本中加入新配制的蛋白酶抑制劑。上樣品時，上樣量過大，應(yīng)減少上樣量。封閉不充分，優(yōu)化封閉時間和封閉試劑濃度?？贵w孵育和檢測一抗/二抗?jié)舛仁欠襁^高，降低抗體濃度。

測試案例

02

實時定量PCR（RT-qPCR）

實驗簡介

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)檢測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析。

實驗原理

以cDNA為模板進(jìn)行PCR，在PCR擴增過程中，通過收集熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以可以定量。在實時PCR擴增過程中，熒光信號被收集，轉(zhuǎn)化為成為擴增和熔解曲線。具體數(shù)據(jù)就是基線，熒光閾值和Ct值。

1.基線（baseline）：一般來講，第3-15個循環(huán)的熒光值就是基線，是由于測量的偶然誤差引起的。

2.閾值（threshold）：閾值一般是基線的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調(diào)節(jié)，位于指數(shù)期就可以。

3.Ct值（Ct value）：Ct值就是熒光值達(dá)到閾值時候的PCR循環(huán)次數(shù)。所以是一個沒有單位的參數(shù)。跟初始模板的量呈反比。

檢測方法

1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
2.TaqMan探針法：
探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。

實驗流程

qPCR常見問題分析

一、無Ct值出現(xiàn)

檢測熒光信號的步驟有誤：一般SybrGreen法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。

1.引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。

2.模板量不足：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

3.模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。

二、Ct值出現(xiàn)過晚（Ct>38）

1.擴增效率低：反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。

2.PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。

3.PCR產(chǎn)物太長：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。

三、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳

1.加樣存在誤差：使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。

2.標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解：應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

3.引物或探針不佳：重新設(shè)計更好的引物和探針。

4.模板中存在抑制物或模板濃度過高

四、負(fù)對照有信號或者溶解曲線不止一個主峰

1.引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

2.引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

3.鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。

4.模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴增。

五、擴增效率低

1.反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

2.反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴增法。

3.反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。

六、同一試劑在不同儀器上產(chǎn)生不同的曲線，如何判斷？

1.判斷標(biāo)準(zhǔn)：擴增效率，靈敏度，特異性；

2.如果擴增效率在90%-110%，都是特異性擴增，都可以把數(shù)據(jù)用于分析。

七、擴增曲線的異常？比如“S”型曲線？

1.參比染料設(shè)定不正確(MasterMix不加參比染料時，選NONE)

2.模板的濃度太高或者降解

3.熒光染料的降解

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一、無Ct值出現(xiàn)

二、Ct值出現(xiàn)過晚（Ct>38）

三、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳

四、負(fù)對照有信號或者溶解曲線不止一個主峰

五、擴增效率低

六、同一試劑在不同儀器上產(chǎn)生不同的曲線，如何判斷？

七、擴增曲線的異常？比如“S”型曲線？